PF-477736的作用 - 生物活性 - 靶点活性

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PF-477736是一种特异的，有效的ATP竞争性Chk1抑制剂（Ki：0.49 nM），还抑制FGFR3，Aurora-A，VEGFR2，Flt3，Fms（CSF1R），Ret和Yes。那么它的生物活性是什么？如何做实验呢？下面让小编给您详细说明。

首先我们介绍PF-477736的生物活性：

1）体外活性

PF-477736（128nM）在CA46和HeLa细胞中以剂量依赖性方式消除喜树碱诱导的DNA损伤检查点。PF-477736有效地消除了吉西他滨诱导的S期阻滞，HT29细胞中凋亡细胞群的相应增加。PF-477736（540nM）在HT29细胞中以时间和剂量依赖性方式增强吉西他滨诱导的细胞毒性。在MTT测定中，PF-477736增强了一组化学治疗剂在广谱p53缺陷型人癌细胞系中的生长抑制活性。

向吉西他滨阻滞细胞添加PF-477736（360nM）诱导H2AX磷酸化强度的显着增加，反映了DNA损伤位点附近的更多数量的γ-H2AX分子。[1] PF-477736（0.5 nM）在HL-60细胞中在姜黄素存在下选择性地阻断p73和P53磷酸化。[2] PF-477736（360 nM）抑制多西紫杉醇诱导的组蛋白H3（Ser10）和Cdc25C（Ser216）的磷酸化，并加强COLO205细胞的凋亡。[3] PF-477736（250 nM）与MK-1775结合在OVCAR-5细胞中具有显着的协同细胞毒活性。

PF-477736（250nM）与MK-1775结合导致OVCAR-5细胞中DNA含量在2N和4N之间的细胞积累。PF-477736（250 nM）与MK-1775结合导致DNA复制结束前的过早有丝分裂，受损的DNA导致OVCAR-5细胞中的凋亡细胞死亡。[4]

2）体内活性

PF-477736（4mg / kg i.v.）导致大鼠的终末半衰期（T1 / 2）为2.9小时，AUC为5.72μg/ hr / mL，CLp为11.8mL / min / kg。PF-477736剂量依赖性地增强Colo205异种移植小鼠模型中最大耐受剂量的吉西他滨的抗肿瘤活性。PF-477736（12mg / kg）诱导Colo205异种移植小鼠模型中组蛋白H3（Ser10）和磷酸 - 组蛋白H2AX的磷酸化增加。[1]

PF-477736（15mg / kg i.p.）在COLO205和MDA-MB-231异种移植模型中增强多西紫杉醇诱导的肿瘤生长抑制和肿瘤生长延迟。[3] PF 477736（10mg / kg，每天一次i.p.）与MK-1775（30mg / kg，每天两次口服）组合，导致携带OVCAR-5异种移植物的小鼠中更大的肿瘤生长抑制。[4]

我们已经了解了PF-477736的生物活性，接下来如何做活性实验呢？一般来说，有如下的三种方法：

1）细胞实验

IC50测定法测量PF-477736对p53缺陷型人癌细胞系的抗增殖作用。将每个细胞系中的细胞以指数增长的密度接种在完全培养基中的96孔测定板中并使其附着16小时。然后进行PF-477736的系列稀释，并向每个板中加入适当的对照。将细胞与药物一起孵育96小时。温育后，将在完全培养基中稀释的MTT工作原液加入每个孔中，并将细胞温育4小时。离心并除去上清液后，向各孔中加入DMSO，在SpectraMax平板读数器上在540nm处读板。

2）动物实验

化学治疗剂或PF 477736（PF-00477736）通过腹膜内施用。当肿瘤在指定的治疗方案中体积为100至150mm 3时进行注射。吉西他滨在一系列剂量下给药，包括小鼠的最大耐受剂量（MTD），根据每3天一次进行四次治疗（q3d×4）时间表。PF477736在吉西他滨后24小时开始根据q3d×4方案在一系列剂量（4-60mg / kg）下施用。考虑到对i.p.的行为反应的严重性，PF 477736的MTD被确定为40mg / kg。给药和体重减轻5％至10％。对于细胞毒性药物，MTD的平均体重减轻的发生率为5％~10％[1]。

3）激酶实验

结合试验：该试验在96孔板中在30℃下在含有50mM TRIS pH 7.5,0.4M NaCl，4mM PEP，0.15mM NADH，28单位乳酸脱氢酶的0.1mL试验缓冲液中进行20分钟/ mL，16单位丙酮酸激酶/ mL，3mM DTT，0.125mM Syntide-2,0.15mM ATP和25mM氯化镁。用1nM的CHK1激酶结构域开始测定。通过在不同浓度的PF-477736存在下测量初始速度来确定CHK1活性的抑制。使用Enzyme Kinetic和Excel软件分析数据，并拟合竞争性抑制的动力学模型以获得Ki值。通过以1μM或10μM针对约100种蛋白激酶的组2筛选化合物来评估PF-477736的激酶选择性。

今天介绍了PF-477736的作用，并且详细地说明了它的生物活性和实验方法。综上所述，PF-477736是一种有效的，ATP 竞争性的 Chk1 抑制剂，Ki 为0.49 nM，对其选择性是Chk2 (Ki, 47 nM) 的100 倍。它的靶点活性是c-Fms,10nM(Ki)；Chk1,0.49nM(Ki)；Chk2,47nM(Ki)；VEGFR2,8nM(Ki)；Yes,14nM(Ki)。

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参考文献：

1. Blasina A, et al. Mol Cancer Ther, 2008, 7(8), 2394-2404.

2. Chakraborty J, et al. J Biol Chem, 2010, 285(43), 33104-33112.

3. Zhang C, et al. Clin Cancer Res, 2009, 15(14), 4630-4640.

4. Carrassa L, et al. Cell Cycle, 2012, 11(13), 2507-2517.

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