肿瘤细胞代谢的研究是近年肿瘤领域的研究热点之一。研究发现大部分的肿瘤促进因子或抑制因子直接影响肿瘤细胞代谢分子。其中糖酵解分子的表达、活性及调控对肿瘤的发生、发展、转移、消退起着至关重要的作用。在肿瘤细胞增殖过程中，糖酵解所涉及的分子，包括转运分子、关键酶及限速酶，都成为新的抗肿瘤药物靶点。相应的，以肿瘤细胞代谢为靶向的新药研发也成为当今新型抗肿瘤药物研发的主要方向之一。 图片来源于网络，侵删
6-磷酸果糖-2-激酶/果糖-2, 6-双磷酸酶(PFKFB) 分子是目前受明显关注的影响肿瘤代谢的一组分子。PFKFB是控制果糖-2,
6-二磷酸(F-2, 6-BP)水平的家族性双功能酶。这类酶的N端能在F-6-P与ATP存在的条件下合成F-2, 6-BP。相反的, PFKFB也能在果糖-2,
6-二磷酸酶C端作用下催化上述反应的逆反应，即F-2, 6-BP水解为F-6-P和无机正磷酸盐。在葡萄糖的代谢过程中，6-磷酸果糖-1-激酶(PFK-1)
催化F-6-P转变成果糖-1, 6-二磷酸(F-1, 6-BP)是关键的限速步骤。而PFKFB的产物F-2,
6-BP是PFK-1强的激活剂。因此，抑制PFKFB的表达或活性进而降低F-2,
6-BP水平，可抑制PFK1的活性，进而抑制细胞糖代谢，最终抑制细胞的增殖。相应地，调节PFKFB及F-2, 6-BP的水平可以抑制肿瘤的发生发展。
哺乳动物的PFKFB有4种异构体，其中PFKFB3是目前与肿瘤相关的PFKFB靶标。PFKFB3编码的6-磷酸果糖-2-激酶(PFK2)激酶活性较其磷酸酶活性高700余倍，而由PFKFB1、2、4编码的PFK2其激酶活性比其磷酸酶活性稍高或两者活性相当。无论是实验性的离体及在体肿瘤生长，都需要PFKFB3存在。很多来自人的肿瘤标本中，与其相邻近的正常细胞相比，肿瘤细胞中PFKFB3的表达明显增高
，这些肿瘤包括胶质瘤、乳腺癌、结肠癌、肺癌、胰腺癌、前列腺癌及卵巢癌等。
来自佛山科学技术学院、广州中医药大学基础医学院、北京大学深圳研究生院的研究人员利用大肠杆菌表达系统，通过在感受态细胞BL21(DE3)中转入PFKFB3原核质粒，经终浓度为25μg/ml的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导，在16℃培养细菌过夜，表达PFKFB3重组蛋白。冰上超声破菌，离心收集蛋白，通过镍
(Ni) 柱亲和层析和分子筛纯化蛋白，运用焦磷酸-磷酸果糖激酶 (PPi-PFK) 法测定PFKFB3酶活性。
蛋白丰度图谱结果显示，PFKFB3蛋白经过Ni柱亲和层析和分子筛纯化后，基本只有1个 PFKFB3的强吸收峰，纯化效果良好。
应用考马斯亮蓝法测定PFKFB3蛋白浓度为2~4μg/μl, 成功获得了较高纯度和浓度的PFKFB3重组蛋白。
通过 PPi -PFK 酶活性分析法测得 PFKFB3 的果糖 -6- 磷酸 (F-6-P) 和三磷酸腺苷 (ATP) 位点的米氏常数 (Km)
值分别为 142.5、34.21 μmol/L。
这项研究构建了PFKFB3的原核表达载体，通过大肠杆菌表达后，提取纯化PFKFB3蛋白并对其酶性质进行了测定，为PFKFB3结构和功能的进一步研究及抑制剂的筛选提供材料并奠定基础。
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发表于 2024-4-12 22:37:39
